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目標：這幾年，肥胖的人口以驚人的速率成長；肥胖已經成為現今全球的一個健康問題。我們讓C57BL/6J老鼠長期攝取茶葉中的兒茶素，並研究此廣泛被亞洲人攝取的天然多酚化合物對這些老鼠之肥胖所產生的影響。

設計：我們讓老鼠攝取十一個月的低脂(含5%的三甘油脂(TG))、高脂(含30%的TG)，或是附帶補充0.1-0.5%(w/w)之兒茶素的高脂飲食，並對其體重、脂肪組織質量，以及肝臟中的脂肪含量加以測量。我們讓這些老鼠採用這三種不同的飲食型態，並於一個月後測量其β-氧化反應的活性和相關mRNA的濃度。

結果：在飲食中補充兒茶素能使因高脂飲食所引起的體重增加情形、內臟和肝臟中的脂肪堆積程度，以及胰島素過多(hyperinsulinemia)和hyperleptinemia的疾病進程明顯趨於緩和。讓老鼠持續採用補充兒茶素的飲食一個月後，其體內的acyl-CoA氧化酵素和medium chain acyl-CoA脫氫酵素(dehydrogenase) mRNA的表現力，以及β-氧化作用在肝臟的活性皆會明顯增加。

結語：肝脂質新陳代謝的刺激是導致茶葉中的兒茶素具有對抗肥胖之功效的一項因素。現有的結果顯示，長期攝取茶葉中的兒茶素有助於對飲食所造成之肥胖的抑制，也可能降低糖尿病和冠狀動脈心臟病等相關疾病的罹患率。

International Journal of Obesity (2002)26, 1459-1464. doi：10.1038/sj.ijo.0802141

 

keywords：tea catechins；obesity；visceral fat；liver fat；β-oxidation

 

這幾年，肥胖的人口以驚人的速率成長；肥胖已經成為現今全球的一個健康問題。大家普遍認為肥胖是由能量的吸收和消耗產生不平衡所致；肥胖是罹患和胰島素耐性(resistance)有關之第二型糖尿病的重要危險因子^{1, 2}。

    綠茶是亞洲地區最受歡迎的飲料之一，它含有一系列的多酚—即眾所周知的兒茶素(catechins)。兒茶素主要是由epigallocatechin gallate(EGCG)、epicatechin gallate，以及gallocatechin gallate所組成。已有報告指出茶葉和茶葉的成分具有許多生物和藥理的功效，如：抗菌³、抗癌的活性⁴，以及降低血漿中脂質和葡萄糖濃度的能力^{5, 6}。因此，越來越多人對茶葉中的兒茶素(或稱為天然的多酚)在治療和預防疾病上的應用感到興趣⁷。

    最近由Kao氏等人所發表的報告指出，經老鼠之腹膜所注入的EGCG會透過不倚賴leptin接受器的路徑(pathway)而減輕其食慾，並減少其食物攝取量^{8, 9}。Dulloo氏等人證實，攝取茶葉中的兒茶素會刺激人體對氧氣和能量的消耗，並使呼吸商數(respiratory quotient)減少¹⁰。此外，已有報告指出綠茶萃取物會刺激棕色脂肪組織的生熱反應和脂肪的氧化作用，而且研究人員認為綠茶萃取物的產熱特性主要是由於其所含之大量兒茶素和咖啡因與交感神經所釋放之正腎上腺素(nor- adrenaline)之間的互動所致¹¹。我們根據之前的研究報告推測，飲茶中的兒茶素會藉由調節全身能量的代謝而影響肥胖的發展過程。但是，研究人員尚未完全確定長期攝取茶葉中的兒茶素對因飲食不當而導致的肥胖所產生的作用。

    C57BL/6J的老鼠是因飲食不當而造成之肥胖的知名模範。目前這項研究的目的是以定量的方式探討飲茶中的兒茶素對這些老鼠之肥胖發展過程的影響¹²。此外，為了了解此作用在某特定分子濃度之下的根本機轉，我們著手探討茶葉中兒茶素對與脂質代謝相關之基因的表現力所產生的影響。

 

研究人員從綠茶(Camellia sinensis)中分離出兒茶素(tea catechins)；其成分如前所述¹³。其中多酚的總含量佔92%、兒茶素(catechin)的總含量佔73%(w/w)，而咖啡因的含量則佔0.1%。被分離之茶葉兒茶素的成分包括epigallocatechin gallate (74%)、epicatechin gallate(18%)、gallocatechin gallate(6%)，以及其他的物質(2%)。

 

實驗1. 研究人員在日本Clea(日本東京)取得七週大的C57BL/6J雄性鼠後，將其飼養在23±1℃的環境中，並固定於07:00到19:00提供光源，剩餘的12小時則將燈光熄滅。為了穩定其代謝情況，研究人員持續一個星期以實驗室的食物做為這些老鼠的飲食。這些老鼠被分成五組(每個籠子裡有五隻)，而且可隨意地飲水並採用下列任一的合成飲食：包含5%(w/w)之脂肪、20%之酪蛋白、66.5%之馬鈴薯澱粉、4%之纖維素、3.5%之維他命，以及1%之礦物質的低脂飲食；包含30%之脂肪、20%之酪蛋白、28.5%之澱粉、13%之蔗糖、4%之纖維素、3.5%之維他命，以及1%之礦物質的高脂飲食；由合併定量兒茶素之高脂飲食所形成的兒茶素飲食。這些老鼠採用這些飲食長達十一個月之久。脂肪中所含的脂肪酸成分包括46.7%的亞麻油酸、36.0%的油酸、7.5%的α亞麻油酸，以及5.7%的棕櫚酸。

 

實驗2. 老鼠被分成三組(每個籠子裡有五隻)，而且可隨意攝取各自的合成飲食長達一個月。研究人員在實驗的最後一天會把所有的老鼠殺死，並快速切開每隻老鼠的組織樣本以進行β-氧化反應的測定和Northern blot的分析。

 

在整個實驗期間，研究人員每週都會測量這些受試鼠的體重。其每週的食物攝取量也會以每個籠子為單位而被測量確定。

 

這些老鼠在經3-4個星期的餵食後，其排泄物以每個籠子為單位被收集四次。研究人員待這些排泄物變乾後，依Folch氏等人的做法取出排泄物中的總脂質¹⁴，再以秤重的方式判定這些脂質的總量。

 

研究人員會在實驗的最後一天將這些老鼠麻醉，並經由後腔靜脈(post-caval vein)取得其血液(未禁食的情況下)。研究人員會於實驗結束前10天在受試鼠禁食的情況下將其尾巴切下以收集血液樣本，並依前所述對其血漿進行分析¹⁵。

 

研究人員會根據Folch氏等人的做法將受試鼠肝臟中的總脂質取出¹⁴，並依前所述對其加以測量¹⁵。

 

研究人員幾乎完全依照之前所述的方式¹⁶測量β-氧化反應的活性。待冰凍的老鼠肝臟、骨胳肌肉(gastrocnemius and soleus)、肩胛間的棕色脂肪組織(brown adipose tissue，簡稱BAT)，以及小腸黏膜解凍後，研究人員以含有1 mM EDTA和10mM HEPES(pH 7.2)之5 vols of 250 mM的蔗糖將其平均分佈在冰上，並在600g予以離心五分鐘，而最後浮在表層的東西會被用來進行分析。最後容積為200μl的反應混合劑中包含Dulbecco’s phosphate-buffered saline(pH 7.2)、1mM ADP、1mM MgCl₂、0.25 mM CoA、1mM L-carnitine、0.5mM L-malic acid、1mM DTT、0.2mg/ml BSA、0.1μCi【¹⁴C】-palmitic acid，以及含有100μg蛋白質的萃取物。此反應在加入酵化物並於37℃的環境下持續培養製劑25分鐘後開始，最後則是藉由加入200μl的0.6N perchloric acid而結束。研究人員透過800μl n-hexane三度抽取出浮在表層的東西以移除利用放射性同位素示蹤的剩餘棕櫚酸鹽(palmitate)，也對water phase的放射性加以測量。研究人員利用DC蛋白質測定裝備對蛋白質的濃度加以判定(Bio Rad, Hercules, CA, USA)。

 

研究人員在實驗2最後一天的9:00~11:00間殺死老鼠，並將其肝臟快速切下以抽取其中的RNA。研究人員利用Isogen(Wako)並根據廠商的指示分離出全部的RNA。Purified RNA(20μg) was electrophoresed on 1% agarose/formamide gels and blotted onto Hybond-N+ membranes(Amersham Pharmacia Biotech, Buckingham- shire, UK). blotted膜於一夜間42℃之下和³²P-labeled cDNA probe雜交。研究人員將這些膜洗淨後，予以放射能照相，並用BAS2000生物圖像分析器進行分析(Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)。這些膜也會和³²P-labeled 36B4 probe雜交(hybri- dize)，而研究人員推測mRNA的濃度和36B4 mRNA的濃度是相應的。正常的數值以百分比表示；以採用低脂飲食之老鼠為對象所取得的數值為100%。由PCR所產生的cDNA probes如下：ACO(Genbank AF006688, nt 218-880)、MCAD (J02791, nt 671-1199)、FAS (X13135, nt 336-1483)，以及36B4(X15267, nt 97-860)。

所有的數值都是以平均值±標準差的方式呈現。ANOVA為所有群組之受試鼠做了統計上的比較。研究人員透過Fisher’s PLSD test將每一群和其他的比較(Stat- View, SAS Institute Inc., NC, USA)。統計的意義被定義成P＜0.05。

 

如圖1A所示，由高脂飲食所造成體重的增加程度會透過餵予含有0.2和0.5% (w/w)茶葉兒茶素的飲食而明顯減輕。雖然研究人員發現被餵予高脂飲食和0.1或0.2%茶葉兒茶素之老鼠的平均能量攝取量並無明顯的不同，但被餵予0.5%茶葉兒茶素之

 

圖1. 茶葉兒茶素對體重(A)和能量的累計攝取量(B)所產生的作用。(A)的每一點代表五種老鼠的平均體重。(B)以每個籠子為單位，每星期測量一次其能量的攝取量。研究人員測出能量的累計攝取量為每隻老鼠每天之能量攝取量(kcal)的七倍。實驗的最後，*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001 vs the high-fat group。

 

老鼠的能量攝取量則低了5.6%(表1)。與被餵予高脂飲食的老鼠相比，被餵予0.5%茶葉兒茶素之老鼠的體重會在12週之後明顯下降(P＜0.05)，而在這期間，這兩組老鼠能量攝取量的累計數值幾乎完全相同(圖1B)。被持續餵予0.2%茶葉兒茶素之老鼠的體重會在27週之後明顯下降(P＜0.05)。

    為了探討茶葉兒茶素對內臟脂肪堆積所能產生的作用，我們對三隻老鼠之脂肪墊(fat pads)上的脂肪分佈加以分析。與高脂飲食相比，補充茶葉兒茶素能明顯抑制附睪、後腹膜，以及腎周圍等處脂肪的堆積(表1)。這些結果顯示攝取茶葉兒茶素有助於抑制身體脂肪的堆積。

 

表1記載了肝臟的重量和脂質的含量。與低脂飲食相比，攝取高脂飲食會使肝臟中三甘油脂的含量明顯增加。但是，以三甘油脂的含量而言，被餵予0.2和0.5%茶葉兒茶素之老鼠體內三甘油脂的含量比攝取高脂飲食之老鼠低很多。請注意我們發現各組受試對象體內肝臟的膽固醇含量皆無明顯的差異。

 

此試驗和之前的研究結果相符^{12, 15}：與攝取低脂飲食的老鼠相比，在禁食和非禁食的情況下，攝取高脂飲食之老鼠血漿中胰島素和leptin的濃度皆明顯較高(表2)，這表示這些老鼠在實驗期間會發生胰島素過多(hyperinsulinemia)和hyperleptinemia的現象。但是，和攝取高脂飲食的老鼠相比，研究人員證實補充0.2和0.5%茶葉兒茶素之老鼠血漿中胰島素和leptin的濃度會明顯受抑制。

 

為了解釋茶葉兒茶素之功效的作用機轉，我們對脂肪酸β-氧化反應在不同組織中的活性加以探討；但是，我們很難判定此研究中脂質代謝的變化究竟是身體脂肪堆積減少的主要原因還是次要結果。因此，我們在受試鼠持續接受餵食的一個月後，探討其β-氧化反應的活性(實驗2)；所有攝取高脂飲食之受試鼠的食物攝取量和體重在這個時間點上皆無明顯差異。在所有被審視的器官中，研究人員發現肝臟所發生的變化最為明顯。如圖2所示，茶葉兒茶素會分別以285和180%的比例，使攝取低脂和高脂飲食之老鼠體內β-氧化反應的活性明顯增加，而這表示攝取茶葉兒茶

 

表1 能量攝取量、排泄物中的脂質含量、肝臟中的脂質含量，以及內臟的脂肪重量

                                                                                                    高脂+茶葉兒茶素(%)

                                                            低脂    高脂            0.1            0.2       0.5 

研究人員每星期會以每個籠子為單位，對受試鼠一天的能量攝取量加以測定。這些老鼠在經過3-4個星期的餵食後，其排泄物以每個籠子為單位，一天被收集四次。待這些排泄物變乾後，研究人員對其中的脂質含量加以測定。這些老鼠在經過11個月的餵食後，其肝的重量、肝臟中的脂質含量，以及內臟脂肪的重量皆會被測量。這些數值是五組受試鼠個別的平均值±標準差。

^aP＜0.05, ^bP＜0.01 and ^cP＜0.001 vs the high-fat group。

 

 

 

 

表2 血漿的分析

                                                                                                    高脂+茶葉兒茶素(%)

                                                低脂       高脂               0.1               0.2       0.5 

研究人員在實驗1的最後一天，經由受試鼠的後腔靜脈(post-caval vein)採集其在非禁食情況下的血液樣本。研究人員會於實驗結束前10天在受試鼠禁食的情況下將其尾巴切下以收集其血液樣本。這些數值是五組受試鼠個別的平均值±標準差。

^aP＜0.05, ^bP＜0.01 and ^cP＜0.001 vs the high-fat group。

 

圖2. 茶葉兒茶素對肝、小腸、肩胛間的棕色脂肪組織(brown adipose tissue，簡稱BAT)，以及骨骼肌肉中β氧化反應活性所產生的作用。研究人員會使連續一個月攝取不同特殊飲食之受試鼠的每個器官同質化，並依之前在方法欄所述的方法對【¹⁴C】-palmitic acid氧化反應的活性加以測量。研究人員以數值的百分比來表達攝取低脂飲食之受試鼠體內的酵素活性。這些數值是五組受試鼠個別的平均值±標準差。

^***P＜0.001 vs the high-fat group。

 

 

素會刺激脂質在肝臟中分解。相互對照之下，研究人員發現攝取高脂和茶葉兒茶素飲食之兩組受試鼠的小腸、肩胛間的棕色脂肪組織，以及骨胳肌肉中β氧化反應的活性並無明顯差異。

 

我們透過Northern blotting，對和肝臟脂質代謝有關之因子中mRNA的濃度加以分析(實驗2)。與攝取高脂飲食之受試鼠體內的濃度相互對照(圖3)，補充茶葉兒茶素會使受試鼠體內acyl-CoA氧化酵素(oxidase)(ACO)中mRNA的表現力增加；acyl-CoA氧化酵素(ACO)是一種peroxisomal β氧化反應的酵素，也是肝臟中一種粒線體β氧化反應的酵素—medium-chain acyl-CoA脫氫酵素(dehydrogenase)(MC- AD)。另外一方面，高脂飲食會降低脂肪酸synthase(fatty acid synthase，簡稱FAS) mRNA的濃度，而且研究人員在予以補充茶葉兒茶素後，發現情況並無明顯變化。

 

圖3. 茶葉兒茶素對ACO、MCAD，以及FAS mRNA在肝臟中之表現力所能發揮的作用。研究人員先讓受試鼠攝取不同的特殊飲食持續一個月，再如方法欄所述，透過Northern blotting(A)對從肝臟分離出的全部RNA加以分析。研究人員利用BAS 2000生物圖像分析器將mRNA的總量定量，並以攝取低脂飲食之受試鼠體內mRNA總量的百分比作為其表現方式(B)。這些數值是五組受試鼠個別的平均值±標準差。

^**P＜0.01, ^***P＜0.001 vs the high-fat group。

 

我們在這項研究中探討茶葉兒茶素對C57BL/6J老鼠的肥胖問題所能產生的效用。目前的研究結果明確地顯示，讓受試鼠攝取茶葉兒茶素有助於抑制其因飲食不當而產生的肥胖現象。我們證實，此研究中所採用之茶葉兒茶素的劑量(0.1-0.5%)並不會增加糞便中的脂質分泌量(表1)。此外，研究人員發現攝取高脂飲食和0.1-0.2%茶葉兒茶素之兩組受試鼠的平均能量攝取量並無明顯差異。攝取0.5%茶葉兒茶素之受試鼠的能量攝取量會稍微偏低；但是，我們難以判定能量攝取量的減少是否為身體脂肪累積程度降低的原因。以攝取含有0.5%茶葉兒茶素之飲食的受試鼠而言，其體重會在十二週後就明顯下降，但其能量攝取量並無明顯減少的情形(圖1)；這表示我們不能將茶葉兒茶素所能發揮之對抗肥胖的功效完全歸因於能量攝取量的減少。更確切地說，另外有些會導致能量消耗的作用機轉可能和茶葉兒茶素對抗肥胖的作用有關。這些研究結果暗示茶葉兒茶素能有效地活化肝臟脂肪酸的β氧化反應，並可能指出茶葉兒茶素所能發揮之益處的根本作用機轉。考慮到兒茶素的吸收作用和反應變化，此物質會影響肝臟這個說法就顯得合理。之前對兒茶素之代謝所進行的研究已經證實，兒茶素會透過腸道被吸收，而且肝臟被發現含有高濃度的兒茶素^{17, 18}；這表示此器官對飲食中的茶葉兒茶素很敏感。因為肝臟是眾所周知能產生β氧化反應作用的器官^{19, 20}，所以肝臟脂質代謝的up-regulation可能會抑制肝臟和內臟脂肪的堆積。另外一方面，茶葉兒茶素不會改變脂肪酸synthase(fatty acid synthase，簡稱FAS)的mRNA濃度，而這可能表示茶葉兒茶素的主要作用是刺激脂肪酸的氧化反應，而非抑制脂肪的產生。

    我們最近透過推算性人類斷層攝影法證實，以每天600毫克的劑量長期攝取茶葉兒茶素能降低內臟脂肪的質量²¹。假設綠茶泡液含有1g/l的兒茶素²²，每日攝取600 ml的綠茶被認為能減輕和內臟脂肪相似質量的體重。

    有報告指出，服用綠茶萃取物會增加人類¹⁰和老鼠體內棕色脂肪組織中的脂肪氧化反應以及能量消耗¹¹，而這被認為可歸因於綠茶萃取所含之大量兒茶素和咖啡因之間的相互作用。因為兒茶素能抑制catechol-O-methyltransferase(會分解正腎上腺素的酵素)，而咖啡因能抑制由phosphodiesterase所誘發之cAMP的分解作用，所以研究人員認為這些化合物會相互延長並加強對脂肪氧化反應的交感刺激¹¹。但是，目前這項研究中所採用之茶葉兒茶素所含的咖啡因比之前研究所使用之茶葉萃取物的咖啡因含量低很多；因此，茶葉兒茶素對脂質代謝所產生的刺激效果可能可以歸因於兒茶素，而非咖啡因本身。目前的研究發現，茶葉兒茶素會增強肝臟中伴隨出現相關因子表現力的β氧化反應。與目前的研究結果相較之下，之前研究所發現透過兒茶素和咖啡因聯合刺激能量的消耗和脂肪的氧化作用是一種相當劇烈的反應。我們已經證實，肝臟β氧化反應酵素的up-regulation不會在攝取茶葉兒茶素之後的24小時內發生(未顯示數據資料)。因此，目前研究中所觀察到之茶葉兒茶素的作用機轉可能和伴隨著咖啡因出現的兒茶素之作用機轉不同。這些研究結果顯示，單次攝取富含兒茶素和咖啡因的綠茶可能會經由交感神經系統刺激脂肪的氧化反應，而長期攝取綠茶則能透過up-regulateβ氧化反應的路徑(pathway)，更進一步地刺激脂肪的氧化反應。因此，茶葉兒茶素具有影響身體脂肪堆積的潛力。

    目前研究人員對茶葉兒茶素刺激脂質代謝的確切分子作用機轉尚不清楚。在過去十年，以下的現象變得很明顯：peroxisome proliferator-activated receptors(PPARs)會以轉錄的方式調整ACO和MCAD等許多能代謝脂質之酵素的表現力²³。我們透過能將chimeric GAL4 DNA binding domain(DBD)-PPARα ligand binding domain (LBD)接受器和包含GAL4 連結部位(binding sites)之接受器因子結合的瞬間trans- fection試驗(transient transfection assay)證實，一系列的兒茶素(EGCG、ECG、GCG等)並非PPARα的ligand。另外一方面，有報告指出細胞核因子-KB(nuclear factor- KB，簡稱NF-KB)會透過PPARα和NF-KB p65自然的互動，抑制受PPAR反應元素驅策並有PPARα居間之催化劑的活化²⁴。因為兒茶素沒食子酸鹽(catechin gallates)會抑制NF-KB的活化^{25, 26}，所以攝取茶葉兒茶素能藉由減少NF-KB的活化作用調整和PPAR相關因子的轉錄。我們需要做更進一步的研究以闡明和茶葉兒茶素所誘發之因子表現力有關的轉錄調節作用機轉。

    總括來說，我們證實長期攝取茶葉兒茶素有助於抑制因為高脂肪飲食而引發的肥胖，而此功效至少在某種程度上可歸因於肝臟脂質代謝的活化。這些結果顯示攝取充分的茶葉兒茶素能調整脂質的代謝，並藉此避免肥胖的發生或減輕肥胖程度，同時也可能降低罹患糖尿病和冠狀動脈心臟病等相關疾病的機率。